SDS-PAGE protocol

 

电泳相关溶液的配置:

130%丙稀酰胺混合溶液(100ml):称取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺,用水溶解定容到100ml,过滤,4摄氏度保存一个月。

2 5×SDS电极缓冲液:称取Tris base15.1g,甘氨酸94.gSDS 5.gdH2O定容至1000ml

32×样品缓冲液(10ml):甘油2ml,溴酚蓝0.0202g1MTris·ClpH6.81ml巯基乙醇0.14ml10%SDS 4ml

4、染色液的配制(1000ml:

  用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸;在电子天平上称取0.125%考马斯亮蓝R250 1.25g,再将其一一加到1000ml锥形瓶中,用蒸馏水加以补足至1000ml。加入的先后顺序为:考马斯亮蓝R250,甲醇或者乙醇,蒸馏水,乙酸。充分混匀后进行过滤,收集滤液备用。当过滤速度变慢时要更换滤纸,快速过滤完,不可隔夜以免影响染色效果。

5、脱色液(1000ml:

   用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸670ml蒸馏水加入烧杯中,待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶;备用。

 

收集液的SDS-PAGE分析:

1、取20ul收集液,加入5×样品缓冲液5ul,在80℃水浴锅中煮5min。

          

              分离胶配方

Resolving Gel (10ml)

6%

8%

10%

12%

15%

H2O

5.4

4.7

4.1

3.4

2.4

30% acrylamide mix

2.0

2.7

3.3

4

5

4x resolving-gel buffer

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

20% SDS

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

20% APS

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

TEMED

0.008

0.006

0.004

0.004

0.004

               浓缩胶配方(10ml)

H2O

6.9 ml

30% acrylamide mix

1.7 ml

8x stacking-gel buffer

1.25 ml

20% SDS

0.05 ml

20% APS

0.05 ml

TEMED

0.01 ml

 

2、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶,安装好电泳仪,在槽中加入电极缓冲液。

3、按一定顺序在加样孔中加入样品。

4、打开电源将电压调到80v,待样品跑过压缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。

5、将凝胶小心取下放入容器中,加入染色液,用摇床摇2-3h

6、待条带清晰后倒出染色液,加入脱色液过夜

7、将脱色液倒掉,在灯箱下观察

8、用数码相机拍照,分析。